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一种干细胞冻存与复苏方法与流程

日期:2019-08-22 06:11
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摘要:
   造血干细胞是血液系统中的成体干细胞,是一个异质性的群体,具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。它是研究历史*长且*为深入的一类成体干细胞,对研究各类干细胞,包括肿瘤干细胞,具有重要指导意义。血液系统中的成熟细胞寿命极短,因此在人的一生中,造血干细胞需要根据机体的生理需求适时的补充血液系统各个成熟细胞组分。同时在损伤、炎症等应激状态下,造血干细胞也扮演着调节和维持体内血液系统各个细胞组分的生理平衡的角色。在对造血干细胞进行远程运输和储存时,为保持细胞的活性,需要对造血干细胞进行冻存,现有的冻存方法容易对细胞造成一定损伤,不利于造血干细胞的储存,为此,提出一种干细胞冻存与复苏方法。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:一种干细胞冻存与复苏方法,包括如下步骤:

S1、细胞冻存液配制:以质量百分含量计,30~40%人血白蛋白,二甲基亚砜5~15%,羟乙基淀粉占3~6%,余量为无血清培养基,配好的冷存液放在1~8℃的温度条件下低温冷藏;

S2、容器**:用**液对存放干细胞的容器表面进行**,并通过紫外线进行**照射,照射时长5~10分钟;

S3、干细胞检测:对干细胞进行病毒检测,保证干细胞安全可靠;

S4、干细胞处理:将干细胞分成多组放置在经S2**后的不同容器内,并将盛有干细胞的容器放置在1~15℃的无菌环境内存放30~50分钟;

S5、干细胞筛选处理:将S4处理后的干细胞进行离心处理,去除上清液,然后通过显微镜观察干细胞活跃性,挑选出活跃性*强的一组;

S6、冻存:将S5挑选出的干细胞在0~10℃的低温环境下,将干细胞和冻存液加入新的容器中,然后将冻存容器放入程序降温装置,先在2~8℃的温度条件下低温冷藏1~2小时,再在-10~-40℃的温度条件下冷冻12~24小时,再在-40~-80℃的温度条件下冷冻12~24小时,然后将冻存容器放置在液氮中冷冻;

S7、干细胞复苏:将S6中干细胞从液氮中取出,将取出的冻存容器放置在5~15℃无菌环境下解冻3~5小时,然后再浸入在温度为37℃的无菌温水环境中进行解冻2~4小时,并进行匀速摇摆晃动使其融化复苏。

优选的,所述S2中**液为纯度为70~75%的酒精。

优选的,所述S2中紫外线照射环境相对湿度为50~60%、温度为15~20℃,紫外线强度不得低于70uW/cm2。

   与现有技术相比,本发明的有益效果是:本发明提出的方法通过对造血干细胞进行温度梯度冻存与复苏,防止造血干细胞因温度骤降而受到损伤,从而避免了因温度骤降使细胞内外水形成冰晶和细胞变形对细胞造成损害,该方法能够提高造血干细胞的冻存活性,减少造血干细胞的损失。

具体实施方式

   为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。

本发明提供一种技术方案:一种干细胞冻存与复苏方法,包括如下步骤:

S1、细胞冻存液配制:以质量百分含量计,30~40%人血白蛋白,二甲基亚砜5~15%,羟乙基淀粉占3~6%,余量为无血清培养基,配好的冷存液放在1~8℃的温度条件下低温冷藏;

S2、容器**:用**液对存放干细胞的容器表面进行**,并通过紫外线进行**照射,照射时长5~10分钟,**液为纯度为70~75%的酒精,紫外线照射环境相对湿度为50~60%、温度为15~20℃,紫外线强度不得低于70uW/cm2;

S3、干细胞检测:对干细胞进行病毒检测,保证干细胞安全可靠;

S4、干细胞处理:将干细胞分成多组放置在经S2**后的不同容器内,并将盛有干细胞的容器放置在1~15℃的无菌环境内存放30~50分钟;

S5、干细胞筛选处理:将S4处理后的干细胞进行离心处理,去除上清液,然后通过显微镜观察干细胞活跃性,挑选出活跃性*强的一组;

S6、冻存:将S5挑选出的干细胞在0~10℃的低温环境下,将干细胞和冻存液加入新的容器中,然后将冻存容器放入程序降温装置,先在2~8℃的温度条件下低温冷藏1~2小时,再在-20~-100℃的温度条件下冷冻12~24小时,再在-110~-140℃的温度条件下冷冻12~24小时,然后将冻存容器放置在液氮中冷冻;

S7、干细胞复苏:将S6中干细胞从液氮中取出,将取出的冻存容器放置在5~15℃无菌环境下解冻3~5小时,然后再浸入在温度为37℃的无菌温水环境中进行解冻2~4小时,并进行匀速摇摆晃动使其融化复苏。

实施例1

一种干细胞冻存与复苏方法,包括如下步骤:

S1、细胞冻存液配制:以质量百分含量计,30%人血白蛋白,二甲基亚砜5%,羟乙基淀粉占3%,余量为无血清培养基,配好的冷存液放在1℃的温度条件下低温冷藏;

S2、容器**:用**液对存放干细胞的容器表面进行**,并通过紫外线进行**照射,照射时长5分钟,**液为纯度为70%的酒精,紫外线照射环境相对湿度为50%、温度为15℃,紫外线强度不得低于70uW/cm2;

S3、干细胞检测:对干细胞进行病毒检测,保证干细胞安全可靠;

S4、干细胞处理:将干细胞分成多组放置在经S2**后的不同容器内,并将盛有干细胞的容器放置在1℃的无菌环境内存放30分钟;

S5、干细胞筛选处理:将S4处理后的干细胞进行离心处理,去除上清液,然后通过显微镜观察干细胞活跃性,挑选出活跃性*强的一组;

S6、冻存:将S5挑选出的干细胞在0℃的低温环境下,将干细胞和冻存液加入新的容器中,然后将冻存容器放入程序降温装置,先在2℃的温度条件下低温冷藏1小时,再在-20℃的温度条件下冷冻12小时,再在-110℃的温度条件下冷冻12小时,然后将冻存容器放置在液氮中冷冻;

S7、干细胞复苏:将S6中干细胞从液氮中取出,将取出的冻存容器放置在5℃无菌环境下解冻3小时,然后再浸入在温度为37℃的无菌温水环境中进行解冻2小时,并进行匀速摇摆晃动使其融化复苏。

实施例2

一种干细胞冻存与复苏方法,包括如下步骤:

S1、细胞冻存液配制:以质量百分含量计,40%人血白蛋白,二甲基亚砜15%,羟乙基淀粉占6%,余量为无血清培养基,配好的冷存液放在8℃的温度条件下低温冷藏;

S2、容器**:用**液对存放干细胞的容器表面进行**,并通过紫外线进行**照射,照射时长10分钟,**液为纯度为75%的酒精,紫外线照射环境相对湿度为60%、温度为20℃,紫外线强度不得低于70uW/cm2;

S3、干细胞检测:对干细胞进行病毒检测,保证干细胞安全可靠;

S4、干细胞处理:将干细胞分成多组放置在经S2**后的不同容器内,并将盛有干细胞的容器放置在15℃的无菌环境内存放50分钟;

S5、干细胞筛选处理:将S4处理后的干细胞进行离心处理,去除上清液,然后通过显微镜观察干细胞活跃性,挑选出活跃性*强的一组;

S6、冻存:将S5挑选出的干细胞在10℃的低温环境下,将干细胞和冻存液加入新的容器中,然后将冻存容器放入程序降温装置,先在8℃的温度条件下低温冷藏2小时,再在-100℃的温度条件下冷冻24小时,再在-140℃的温度条件下冷冻24小时,然后将冻存容器放置在液氮中冷冻;

S7、干细胞复苏:将S6中干细胞从液氮中取出,将取出的冻存容器放置在15℃无菌环境下解冻5小时,然后再浸入在温度为37℃的无菌温水环境中进行解冻4小时,并进行匀速摇摆晃动使其融化复苏。

实施例3

一种干细胞冻存与复苏方法,包括如下步骤:

S1、细胞冻存液配制:以质量百分含量计,32%人血白蛋白,二甲基亚砜7%,羟乙基淀粉占5%,余量为无血清培养基,配好的冷存液放在5℃的温度条件下低温冷藏;

S2、容器**:用**液对存放干细胞的容器表面进行**,并通过紫外线进行**照射,照射时长6分钟,**液为纯度为76%的酒精,紫外线照射环境相对湿度为56%、温度为16℃,紫外线强度不得低于70uW/cm2;

S3、干细胞检测:对干细胞进行病毒检测,保证干细胞安全可靠;

S4、干细胞处理:将干细胞分成多组放置在经S2**后的不同容器内,并将盛有干细胞的容器放置在11℃的无菌环境内存放32分钟;

S5、干细胞筛选处理:将S4处理后的干细胞进行离心处理,去除上清液,然后通过显微镜观察干细胞活跃性,挑选出活跃性*强的一组;

S6、冻存:将S5挑选出的干细胞在3℃的低温环境下,将干细胞和冻存液加入新的容器中,然后将冻存容器放入程序降温装置,先在3℃的温度条件下低温冷藏1.5小时,再在-21℃的温度条件下冷冻13小时,再在-111℃的温度条件下冷冻13小时,然后将冻存容器放置在液氮中冷冻;

S7、干细胞复苏:将S6中干细胞从液氮中取出,将取出的冻存容器放置在6℃无菌环境下解冻4小时,然后再浸入在温度为37℃的无菌温水环境中进行解冻3小时,并进行匀速摇摆晃动使其融化复苏。

   尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。 
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